熒光定量PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，Taq酶將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。

 

　　熒光定量PCR擴增反應(yīng)的循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動生成也可以手動設(shè)置的。之后反應(yīng)會進入指數(shù)增長期，這個期間擴增曲線具有高度重復性，在該期間，可設(shè)定一條熒光閾值線，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般會將熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值，這個值與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，且該值具有重現(xiàn)性。

 

　　熒光定量PCR特點有：

　　(1)用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴增產(chǎn)物的量，進行實時動態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測，避免終點定量的不準確性，并且消除了標本和產(chǎn)物的污染，且無復雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。

　　(2)熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測物等方法獲得，打打提高了檢測的靈敏度、特異性和準確性。Real-timeO-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測定、細胞因子的表達分析、腫瘤耐藥基因表達的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測。